Plasmid DNA purification,digestion and identification

质粒DNA纯化、酶切与鉴定

试剂和仪器

试剂

1. 纯化
   • Solution1 GET
   • Solution2 NaOH，SDS 新鲜配制
   • Solution3 高盐溶液 4℃保存
   • TE 缓冲液
   • LB 培养基 琼脂粉Agar
   • 含质粒的大肠杆菌DH5α
2. 酶切与鉴定
   • EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ，通用缓冲液
   • 10× TBE缓冲液
   • 6×loading buffer
   • 菲啶溴红染色液： EB（溴化乙锭）
   • Gel-Red荧光染剂 核酸染料
   • DNA Marker

仪器

恒温箱，电泳仪，离心机，紫外灯，凝胶成像仪

实验操作

1. 培养细菌：将单菌落大肠杆菌接种在LB液体培养基，加入适当的抗生素，37℃培养12-18h

2. 纯化质粒DNA：分离细菌染色体、蛋白质、细菌胞膜、细菌核糖体

   1. 收集细菌：1.5ml EP管，离心，弃去上清液
   2. 去除RNA：GET 缓冲液，RNaseA，混匀，室温10min
   3. 溶菌：Solution Ⅱ，颠倒混匀至清亮，冰上5min，==避免震荡==
   4. 沉淀细菌染色体蛋白质：预冷Solution Ⅲ，颠倒混匀，冰上15min
   5. 获取粗提质粒：离心，上清液转移入另一个干净的EP 管
   6. 沉淀质粒：等体积异丙醇，颠倒混匀，室温5min，离心，弃去上清液
   7. 去除杂蛋白： \(\ce{ ddH2O}\)溶解沉淀，\(\frac{1}{2}\)体积\(NH_4Ac\)，颠倒混匀冰浴5min，离心，上清液转移入另一个干净的EP 管
   8. 沉淀质粒DNA：2倍体积无水乙醇，-20℃10min，离心，弃去上清液，吸水纸吸干
   9. 去除EP 管中的盐：70%乙醇，颠倒，离心，弃去上清液，吸水纸吸干
   10. 温箱干燥
   11. 保存待用：-20℃保存或30μL TE缓冲液或\(ddH_2O\)溶解

3. 酶切

   • 标准酶切反应体系（20μL）：
     • 单酶切：
       1. 质粒DNA X μL
       2. 配套的10 × 缓冲液 2μL
       3. \(ddH_2O\) 20-（X+3）
       4. 内切酶 2U（1μL）
     • 双酶切：
       1. 质粒DNA X μL
       2. 通用 10 × 缓冲液 2μL
       3. \(ddH_2O\) 20-（X+4）
       4. 内切酶1 2U（1μL）
       5. 内切酶2 2U（1μL）
   1. 20μL TE缓冲液或\(ddH_2O\)溶解质粒DNA，==浓度？==
   2. EP 管编号，冰上进行，按上述依次加样，混匀
   3. 恒温37℃，酶解2~3h
   4. DNA电泳或-20℃保存

4. 电泳鉴定

   1. 琼脂糖凝胶
   2. 上样：6×loading buffer 含Gel-Red ==上样量？==
   3. 观察：254nm紫外灯 ，DNA红色荧光。305nm紫外灯，EB染色条带。